ADN Recombinante

ADN recombinante natural 

Cuando se tiene una rotura del ADN existen procesos que reparan este daño, puede ser por unión de extremos no homóloga canónica y recombinación homóloga. Para la reparación de ADN, la cromatina se somete a una reorganización y modificación permitiendo el intercambio de histonas canónicas, y entrecruce de material genético de cromátidas hermanas promovido por ATRX. (1)

ADN recombinante artificial de Bordetella Pertussis

T: La administración subcutánea de una proteína de fusión compuesta de toxina pertussis y hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis induce respuestas inmunitarias sistémicas y mucosas

O: Desarrollar nuevas vacunas con ayuda de la tecnología recombinante para contener la extensión de la enfermedad de la tos ferina causada por Bordetella Pertussis

G: Gen F1S1 (1926-bp) amplificado

ER: BamH I para el cebador f1s1F (adelante) y Sac I para cebador f1s1R (reverso)

EL: No especifica

V: Vector de expresión pEt21a

CR: Escherichia coli BL21 (DE3), cultivada en caldo Luria-Bertani (LB)

MTG: Transformación por conjugación bacteriana, inducción de IPTG. 

MIC:  Mediante SDS-PAGE y análisis de transferencia Western con ayuda del anticuerpo monoclonal anti-His (término C) -HRP y un antisuero policlonal (contra la vacuna DTaP), PCR (Reaccion a la cadena de la polimerasa), Prueba ELISA. (2)

Referencias Bibliográficas: 
1.Juhász, S., Elbakry, A., Mathes, A., & Löbrich, M. ATRX Promotes DNA Repair Synthesis and Sister Chromatid Exchange during Homologous Recombination. Molecular Cell [Internet]. 2018 [citado 25 Jul 2021]: 71(1), 11–24.e7. Disponible en: https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(18)30388-5?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS1097276518303885%3Fshowall%3Dtrue
2. Torskashvand A, Bahrami M, Adib M, Ajdary S. La administración subcutánea de una proteína de fusión compuesta de toxina pertussis y hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis induce respuestas inmunitarias sistémicas y mucosas [Internet]. 2018 [citado 25 Jul 2021]: 21 (7): 753-759, Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30140416/

 Técnica de Hibridación para el VIH 

La hibridación in situ fluorescente (FISH) es una técnica que permite visualizar la localización y detección de secuencias específicas de DNA y RNA a través de la hibridación de sondas exógenas. En el caso del VIH se destaca la RNA FISH, método que permite determinar la abundancia y ubicación sub-celular de moléculas de ARN celulares y virales, además de su tasa de transcripción y degradación. Igualmente, para el análisis de la actividad transcripcional de genes endógenos, como también de genes exógenos tales como los pertenecientes a genomas virales integrados. (1)

Referencia Bibliográfica:

1. Leyva A. Desarrollo de sondas acopladas a Quantum dots para analizar la localización subcelular del ARN genómico de VIH-1 mediante microscopía confocal [Internet]. Santiago, Chile: Universidad de Chile - Facultad de Ciencias; 2018 [citado: 2021, junio]. Disponible en: http://repositorio.uchile.cl/bitstream/handle/2250/148975/Tesis%20Alejandra%20Leyva%20Mayo%202018.pdf?sequence=1&isAllowed=y

 Prueba PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para el VIH

Tema: Diagnóstico y caracterización del Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 2 circulante en Uruguay.

Objetivos:

• Actualizar la información del diagnóstico y genotipificación de VIH-2 a través del uso de diferentes técnicas y abordajes experimentales. 
• Emplear la PCR para una mejor amplificación de una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos.

Tipo de muestra biológica: Se la realiza a partir de la extracción de suero y/o sangre total anticoagulada con EDTA, realizado con el kit comercial por columna de sílica (QIAamp® DNA Mini Kit y QIAamp® Viral RNA Mini Kit).

Tipo de ácido nucleico a ser extraído: Amplificación dependiente del tipo de PCR, puede ser ADN proviral y/o ARN genómico mediante el Kit comercial (PureLink® Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit).

Gen o secuencia a amplificar: Gen p17 (posición 787-1184 en HXB2), con un control interno de un fragmento del gen CCR5 celular.

Tipo de PCR: Las mas utilizadas son la RT-PCR, PCR Anidada VIH-1 y VIH-2.

Visualización: Los fragmentos amplificados son analizados en gel de agarosa al 1.5% en Buffer TBE 0.5 X. Además, de ser visualizados en un transiluminado bajo Luz Ultra Violeta (UV). (1)

Referencias Bibliográficas:

1. Montaldo Natalia, Somma Silvana. (2018). Diagnóstico y caracterización del Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 2 circulante en Uruguay. [Internet]. Uruguay: Universidad Nacional del Cuyo - Facultad de Ciencias, UdelaR;  2018 [citado: 2021, julio]. Disponible en: https://librosffyl.bdigital.uncu.edu.ar/objetos_digitales/13066/32-salud-humana-montaldo-natalia-udelar.pdf

 Alteraciones de la epigenómica del VIH

El provirus puede permanecer latente o continuar el ciclo replicativo bajo una expresión génica eficiente. Una vez integrado, el ADN viral es transcrito por la ARN polimerasa II celular, generando un ARN mensajero (ARNm) que por los LTR´s se organiza como una unidad transcripcional (LTR 5´ (promotor/activador) y el LTR 3´ (poliadenilación)). La transcripción del provirus, vía ARNpol II celular, da lugar a un transcrito primario que sirve como ARN genómico incorporado en el virión, o  para proveer todos los ARN mensajeros (ARNm) que codifican las proteínas virales. (1)

Referencias Bibliográficas:

1. Peñailillo Nora. (2017). La expresión del Virus de la Inmunodeficiencia Humana de Tipo 1 (VIH-1) interfiere en el mecanismo de ensamblaje de los Cuerpos de Procesamiento. [Internet]. Santiago, Chile: Universidad Andrés Bello - Facultad de Ciencias Biológicas; 2017 [citado: 2021, julio]. Disponible en:  http://repositorio.unab.cl/xmlui/bitstream/handle/ria/6851/a122977_Penailillo_N_La_expresion_del_Virus_de_2017_Tesis.pdf?sequence=1&isAllowed=y

 

 Alteración de la Traducción del VIH

Una vez dado el proceso de transcripción, el ARNm portador de las instrucciones del virus es transportado desde el núcleo a una especie de cinta transportadora diminuta en la célula. A medida que se procesa cada cadena de ARNm, se desarrollan las cadenas de proteínas correspondiente, continuando hasta la transformación o "traducción" en nuevas proteínas víricas, necesarias para crear más virus. En resumen, la cadena de ARNm abandona el núcleo y las enzimas de la célula huésped traducen el ARNm en proteínas víricas a lo largo del proceso. (1)

Referencias Bibliográficas:

1. Pereyra Gerber, Federico Pehuén; Ostrowski, Matias; Flichman, Diego Martin. (2018). Caracterización de las vías de tráfico intracelular dependientes de RabGTPasas involucradas en la replicación de VIH-1 en linfocitos T CD4+; 29(1), 23-37. Disponible en: https://ri.conicet.gov.ar/handle/11336/91354

 Alteración en la transcripción del VIH

Una vez que el material genético del VIH se encuentra en el interior del núcleo de la célula, dirige la maquinaria genética de ésta para producir nuevos VIH. En su interior, se inicia el proceso de transcripción inversa que facilita la conversión del ARN genómico en ADNc, generando dos secuencias de repeticiones terminales largas en cada extremo del ADN proviral. Una vez formado el ADN viral bicatenario, el virus introduce el material genético en el genoma de la célula hospedera mediante la acción de la enzima integrasa sintetizada por el virus mismo. (1)

Referencias Bibliográficas: 

1. Leyva A. Desarrollo de sondas acopladas a Quantum dots para analizar la localización subcelular del ARN genómico de VIH-1 mediante microscopía confocal [Internet]. Santiago, Chile: Universidad de Chile - Facultad de Ciencias; 2018 [citado: 2021, junio]. Disponible en: 

http://repositorio.uchile.cl/bitstream/handle/2250/148975/Tesis%20Alejandra%20Leyva%20Mayo%202018.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Alteración genómica del VIH 

El VIH al ser un retrovirus presenta un genoma de ARN de cadena simple que requiere ser convertido a ADN complementario (ADNc) para ser integrado al genoma del hospedero (transcriptasa reversa).  Empieza con el primer contacto del virus con la célula hospedera mediado por la interacción de la proteína gp120 al extremo N terminal del receptor CD4 (macrófagos, linfocitos T) de la célula hospedera para poder así liberar su material genético y replicarse. Recordemos que su principal objetivo son las células CD4 con sus receptores para poder invadir al organismo. (1,2) 

Referencias Bibliográficas: 

1. Yábar V Carlos. Eventos moleculares, genéticos e inmunológicos durante la interacción VIH-Hombre. Rev. Perú. med. exp. salud publica [Internet]. 2003 Abr [citado 2021 Jun 14] ; 20( 2 ): 107-115. Disponible en: 
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-46342003000200009.

2. Santana Alfredo, Domínguez Casimira, Lemes Angelines, Molero Teresa, Salido Eduardo. Biología celular y molecular del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Rev Diagn Biol [Internet]. 2003 Mar [citado 2021 Jun 14] ; 52( 1 ): 07-18. Disponible en: https://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-79732003000100001.